干细胞在急性肾损伤中的治疗作用及进展
发布时间 : 2019-01-16

急性肾损伤( acute kidney injuryAKI) 是临床常见的危重症之一,具有高发生率和高病死率的特征。2002 年,急性透析质量指导组( acute dialysis quality initiative groupADQI) 制定了 AKI RIFLE 分级诊断标准,将 AKI 分为 3 个严重程度级别:危险( risk) 损伤( injury) 衰竭( failure) 2 个预后级别: 肾衰竭丧失 ( loss) 终末期肾病 ( end stage renal diseaseESRD) 。 2005 年,急性肾损伤网络( acute kidney injury network,AKIN) 会议在基于 RIFLE 标准上进行修订,将 AKI( 诊断标准) 定义为: 由导致肾脏结构或功能变化的损伤引起的肾衰竭突然( 48 h 以内)下降,表现为血肌酐绝对值增加≥0. 3 mg/dl( ≥26.4 μmol /L) ,或者增加≥50% ( 达到基线值的 1。5 倍) ,或者尿量 < 0.5 ml/kg/h 持续超过 6 h。并将 AKI 分为 1、2、3 期 分别对应 RIFLE 标准的危险损伤和衰竭。AKI 常见病因是肾缺血和肾中毒引起的急性肾小管坏死( acute tubular necrosisATN) ATN与修复的病理生理学机制主要包括: ( 1) 早期: 各种因素( 如:缺血中毒脓毒血症) 引起的肾小管上皮细胞变性去极化刷状缘破坏; ( 2) 坏死期: 上皮细胞坏死脱落阻塞管腔肾小管基底膜暴露; ( 3) 修复期: 健存细胞迁移新生上皮细胞增殖黏附于基底膜,肾小管上皮细胞极性形成结构重建功能恢复 。多年来,尽管血液净化技术和危重症医学得到了突飞猛进的发展,但败血症休克和严重创伤所致 AKI 死亡率仍高达 50% 以上如何提高肾小管上皮细胞坏死后的修复再生降低 AKI 死亡率,一直是医学界研究的一项重大课题随着干细胞医学组织工程学再生医学等学科的迅猛发展,也给 AKI 的修复再生提供了一条新的道路。

1、干细胞的概念

干细胞( stem cells,SCs) 是一类具有自我更新能力的多潜能细胞,在一定条件下可分化为多种功能细胞。根据干细胞的发育潜能可分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞三类。全能干细胞是一种高度未分化细胞,具有无限增殖、自我更新、多向分化等特征。胚胎干细胞( embryonic stem cells,ESCs) 是这类细胞的代表。多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能,可以分化成体内各种细胞,进而形成身体的各种组织和器官,因此其在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。其典型代表是骨髓造血干细胞( hemopoietic stem cells,HSCs) 。专能干细胞是多能干细胞进一步分化的结果,专能干细胞只能分化成某一类型的细胞。

2、胚胎干细胞

ESCs 是来源于囊胚的内细胞团,具有多潜能性。然而,移植不定项分化 ESCs 会诱导畸胎瘤发生。因此,在移植之前必须先在一定程度上对 ESCs 进行分化。通过应用维甲酸、活化素-A (    activin-A) 、骨形成蛋白-4 ( bone morphogenetic protein-4,BMP-4) 、BMP-7 可以让培养的HSCs 诱导表达肾小管上皮细胞标志 KSP、足细胞标志 WT-1 和 Nephrin、中胚层标志Brachyury、后肾间充质标志 Six2 ,WT-1 和Pax2等。此外,注入显影剂观察可发现,ESCs几乎100% 被纳入肾小管上皮细[2]胞 。因此,ESCs 被认为是肾脏修复损伤的最佳细胞来源之一。然而,人类 ESCs 设计相关的伦理和法律问题,使得研究工作不能进一步开展。

3、诱导多潜能干细胞

    为了替代 ESCs,学者们研究开发了多能干细胞 ( iPS 细胞) [3]。最近,人类 iPS 细胞已经成功从皮肤成纤维细胞中诱导生成。通过逆转录病毒转移的 4 个基因( Oct3 /4,Sox2,Klf4和c-myc) 在培养的体细胞中可以转化为类似 ESCs 的多潜能细胞。这 4 个基因被认为是具有全能性的转录因子。由于iPS 细胞类似 ESCs 具有多潜能性,并可以从人类体细胞中诱导生成,这意味着不存在伦理和道德问题,因此是iPS 细胞在AKI损伤修复方面具有相当前景然而,即使 AKI 修复的资源随处可得,iPS 细胞分化诱导的机制仍存在很多空白并且发现iPS细胞存在和ESCs同样的问题,移植未分化的iPS细胞极易形[3]成畸胎瘤。虽然如此,但已经有多篇文献成功报道了多种类 型的体细胞被重编程为 iPS 细胞,包括心血管细胞[5]、造血功能细胞[6]、肝细胞、胃上皮细胞[7]、间充质干细胞( mesenchymal stromal cells, MSCs) 和成熟胰岛β 细胞。此外,研究发现iPS细胞可以不包括原癌基因c-myc[4],这将大大降低畸胎瘤形成的概率。相信今后iPS细胞在AKI损伤修复的舞台上将占据一席之地。

4、骨髓源性干细胞

骨髓包含了各种类型的干细胞,例如: HSCs、MSCs、内皮祖细胞( endothelium progenitor cells, EPCs) 等,它们在AKI的损伤修复中都起到了一定的作用。

4.1 造血干细胞 许多验证性实验表明HSCs对肾小管和肾小球系膜间隙的修复再生具有杰出贡献[8 ~11]。AKI发生后,增加血液中的HSCs 能够进一步作用于其病理生理过程。研究人员在AKI修复再生过程中应用粒细胞集落刺激因子( G-CSF)、或直接输注HSCs,使血液中HSCs增加,观察其疗效并进行研究分析,发现不同研究给出了不同的结果,究其原因可能是由于AKI动物模型的不同、抑或HSCs类型和剂量的不同,抑或试验标准不同。结果究竟如何有待进一步的meta分析结果。 G-CSF治疗能在叶酸导致的AKI损伤后3d 和7d明显改善受损肾组织的结构和功能。这种改善与在肾脏修复再生过程中掺入10%骨髓源性干细胞密切相关[11]。在顺铂诱导的AKI小鼠模型中,动员HSCs,使用G-CSF或巨噬细胞集落刺激因子( M-CSF) ,可以明显改善肾损伤以及动物的生存率[12]。相比之下,动员 HSCs 被证明不利于缺血性ATN小鼠模型[13]。动员HSCs的小鼠其血清肌酐增加水平以及肾小管损伤程度明显高于粒细胞减少小鼠。这可能是由于动员了G-CSF以外的HSCs,如粒细胞,其会进一步加剧 AKI。研究人员正在制定草案关于动员无诱导粒细胞增多的HSCs,作为AKI 治疗的又一个潜在研究方向[13]

4.2 间充质干细胞大量实验研究显示,当AKI情况下给予外源性MSCs可以改善肾小球、肾小管、肾间质的结构和功能的恢复。Togel 等[14]实验显示无论是同源性 MSCs 抑或是异源性 MSCs 对于AKI的治疗都是安全有效的,减少了晚期的纤维化以及肾衰竭的丢失。Morigi 等[15]发现人脐带血间充质干细胞( human cord blood-mesenchymal stem cells, CB-MSCs) 对实验性AKI 具有治疗作用。给由顺铂引起 AKI 的免疫缺陷小鼠注入 CB-MSCs可以改善肾衰竭以及肾小管细胞的损伤情况,增加其存活率。移植的CB-MSCs定位于局部有毛细血管 改建和中性粒细胞浸润的肾小管周围区域。CB-MSCs 通过产生生长因子从而减少细胞凋亡并且增加肾小管细胞的增殖。CB-MSCs 对肾脏的保护作用进一步通过其抑制氧化损伤、诱导肾小管上皮细胞中的促生存因子Akt得到了证实。在 CB-MSCs 与受损肾小管上皮细胞共同培养的实验中证实CB-MSCs 在体外具有促进生长因子增加和抑制IL-1β 和TNF-α 生成的能力,并且具有治疗再生和抗炎作用。 最近研究显示 MSCs 的修复机制并不是直接再生受损肾单位而是通过旁分泌和内分泌作用于受损的肾单位。Tsuda 等[16]研究发现同种异体的胎膜间质干细胞( allogenic fetal membrane-derived MSCs,FM-MSCs) 具有肾脏修复作用。将患有肾炎的大鼠分为两组分别注入同种异体的胎膜间质干细胞(FM-MSCs 组)和磷酸盐缓冲液(PBS组) 。PBS 组的肾炎大鼠表现出尿蛋白大量外排,而 FM-MSCs 组尿蛋白外排不明显( P <0.05) 。此外还发现FM-MSCs 具有减少活化的肾小球系膜细胞增殖、肾小球单核巨噬细胞滤过、肾小球系膜基质积聚、肾小球炎性介质(TNF-α,MCP-1,TGF-β)和细胞外基质表达的功能。实验数据显示FM-MSCs是通过旁分泌来实现损伤修复的。同样,Rampino等[17]也证明了MSCs很少存在于肾单位中,而是通过调节炎性因子和趋化因子( IL-6,TGF-β,PDGF-β,HGF) ,减低血肌酐升高、肾小球病理组织的损伤,从 而修复抗 Thy1 肾炎引起的急性肾损伤。

4.3 内皮祖细胞 EPCs是成熟血管内皮细胞的前体细胞,亦称成血管细胞(angioblast) 。Chade 等[18]研究显示将同源 性 EPCs 进行肾内灌注对肾微血管的结构和功能具有保护作 用,并且能够减少微血管的重塑。此外, EPCs 能形成新血管并 加速其成熟和稳定。在生理或病理因素的刺激下, EPCs 可以 从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。Patschan等[19]证 实了小鼠单侧肾动脉钳夹后3~6h 的肾缺血性AKI能够诱导EPCs快速动员,归巢到脾脏,使其成为已动员EPCs的临时储存库。而后期的AKI缺血再灌注损伤修复又与脾脏储存库EPCs的动员和肾乳头区域EPCs的堆积有关。进行髓质乳头来源浓缩EPCs 的移植对于缺血损伤的肾组织细胞具有部分保护作用,提示EPCs具有维持和修复肾脏内皮细胞的潜在作用。 因此,EPCs将成为促进AKI修复的又一有效手段。

5、肾源性干细胞

在过去的几年里,成人肾干/祖细胞( ARPCs) 已经确定在人类肾脏[20],特别是在肾小囊和近端小管的再生修复中发挥着重要作用,可能成为治疗AKI的理想细胞。 Kim等[21]为了阐明ARPCs的定位和性质,通过免疫组织化学的方法对31个正常婴儿、成人肾脏中干细胞标志物CD133的表达以及CD133和Ki-67、肾小管特异标志物的共同表达进行检测分析,发现 CD133和Ki-67同时表达于婴儿肾脏内,而在成体肾脏中无Ki-67 表达。CD+133 大量储存于近端小管的S3段,并且与远端小管的标志物共同表达,提示ARPCs具有多能性。在正常的成人肾脏内存在着大量的CD+133,其能够作为AKI的病理特征指标。在免疫缺乏性肾小球肾炎的发病过程中, CD133和Ki-67的升高预示着肾衰竭正在恢复中。这些结果显示ARPCs 主要存在于近曲小管的S3段,正常状况下处于有丝分裂静止期,当细胞损伤时可被诱导激活,对受损细胞进行修复再生。Lee 等[22]为了揭示 ARPCs 在肾缺血再灌注性AKI小鼠模型中的修复再生作用行相关实验,实验显示ARPCs 呈纺锤状,具有不断自我更新能力,并且能表达 Oct-4,Pax-2,Wnt-4,WT-1,波形蛋白,α-平滑肌肌动蛋白,CD29 和S100A4 等一系列细胞因子。通过肾内注射ARPCs 对缺血再灌注性AKI 小鼠具有治疗作用,如降低血清尿素氮,对梗死区局限化,减少坏死损伤。伤后7d内,一些ARPCs 形成了含有红细胞的血管,另一些融入了肾小管。此外, ARPCs 治疗明显降低了缺血性损伤后小鼠的死亡率。

6、羊水干细胞

人类羊水干细胞( human amniotic fluid stem cells, hAFSCs) 具有易大量获得、低畸胎瘤发生率、高分化潜能等特性。作为干细胞治疗的新方向,其并不牵扯到胚胎干细胞相关的伦理问题。 Siegel 等[23]将小鼠胚胎的肾脏分离成单细胞悬液与单克隆hAFSCs 混合重新塑形成功形成了肾脏结构,证明hAFSCs 可以通过调节某些免疫机制或分子机制的表达来完成肾组织的修复。作为两个激酶复合物mTORC1 和mTORC2 的一部分,哺乳动物雷帕霉素靶( mTOR) 是一个重要的信号通路,它对许多以肾脏症状为特征的人类遗传疾病的发展以及hAFSCs的分化 具有调节作用。通过特殊的siRNA途径调节内源性的mTOR 活动显示hAFSCs主要是作用于mTOR通路调节mTORC1和mTORC2从而对肾组织进行损伤修复。这些结果显示hAFSCs对肾组织损伤修复具有调节作用;小鼠胚胎肾单细胞悬液和单克隆hAFSCs 的混合物将成为研究肾脏结构再生的强有力工具; mTOR途径为肾脏疾病的研究发展提供了新的视角。Perin 等[24]首次研究成功将 hAFSCs 运用于甘油引起横纹肌溶解症和 ATN 的小鼠模型上。将 hAFSCs 注射入受损肾脏,应用荧光素酶标记进行发光追踪。结果显示 hAFSCs 对ATN 具有保护作用,缓解该阶段 ATN 的急性损伤如降低血液肌酐、尿素氮浓度、肾小管损伤和细胞凋亡的数量,促进肾小管上皮细胞增殖。实验还发现 hAFSCs 对ATN 过程具有显著的免疫调节作用。因此,我们可以推测,hAFSCs 代表了干细胞来源的新功能,可通过调节肾的免疫环境来改善ATN引起的肾衰竭。

7、目前存在的问题与展望

    对于 AKI,干细胞治疗必定是今后的一大趋势,具有很好的发展前景。但仍然存在着很多问题有待解决,譬如:(1) 是否不同原因引起的AKI需要使用不同的干细胞进行治疗? (2) 采用哪种注入方式? 局部注射抑或是血管注射? (3) 是否需要其他的辅助细胞来提高干细胞的修复再生作用? (4) 究竟是何种来源的干细胞对AKI修复再生效果更好? 单用一种干细胞抑或是多种联用? 目前认为虽然有很多来源的干细胞参与了AKI的损伤修复,但起主要作用的可能仍是 MSCs,MSCs 对于AKI的修复作用主要是基于旁分泌或自分泌的细胞因子起作用。这个观点正在为越来越多的学者所接受,但是其治疗AKI的作用机制尚不清楚,有待进一步研究。此外,虽然干细胞研究在动物试验中显示出了一定效果,但在临床上对于治疗AKI是否真的有效仍然有待实践。Behr 等[25]已发现当将MSCs作用于同源大型动物模型时, MSCs 并没有发挥其在小鼠研究中所发挥的对AKI修复和旁分泌作用。另外,目前的研究大多局限于对AKI的研究, 对于慢性肾脏疾病的干细胞治疗也将是今后的一大热点。

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